原子力显微镜/近场光学显微镜系统与荧光寿命成像

摘要：我们成功的把荧光寿命成像（FLIM）系统和原子力显微镜（AFM）集成到一起。这个系统基于NT-MDT的NTEGRA SPECTRA AFM/NSOM系统，和一个Simple-Tau 150 TCSPC FLIM系统。我们利用这个系统观测了大肠杆菌，HEK细胞和聚合物的AFM/FLIM图像。

简介

自从二十世纪九十年代早期现在已经广为人知的共焦和双光子激光扫描显微镜取得成像方面突破性的进展之后，共焦和双光子激光扫描显微镜所特有的多光子激发、光学切片以及超高的对比度使得其成为了生物样品荧光成像的理想选择。
有机分子的荧光不仅仅可以用其激发光谱来特征识别，还可以通过荧光寿命来特征识别。荧光寿命受到激发态分子和其周围环境之间任何可预见的能量转移都会影响荧光寿命。鉴于荧光寿命与浓度无关，因此发色团的荧光寿命测量是一种直接研究所有涉及能量转移过程的方法。典型的研究示例包括研究面阵区域上的细胞参数，比如pH，离子浓度，通过荧光淬灭来研究氧饱和，或者是细胞内不同发色团的荧光能量转移。
把强度与荧光寿命图像结合起来是区分多染色样品内不同的荧光标记物和细胞内不同的自然荧光团的强有力的工具。这些组分的荧光光谱通常会混杂在一起，难以区分，但是通过荧光寿命来区分它们却一目了然。
尽管共焦FLIM提供了样品很多的化学信息，但是它的空间分辨率还是受到了衍射极限的限制。因此科研工作者需要找到一种能够可以和FLIM技术结合起来的高分辨显微技术。而原子力显微镜（AFM）就是这样的一种技术，它可以在纳米尺度上采集生物或者无机样品的形貌。AFM有若干种操作模式，接触、轻触或者非接触。AFM在生物样品上发展的最为成熟的一种模式是轻触模式：探针以其固有的频率震荡，对于柔软的生物样品施加很小的力来得到高精度的形貌特征。AFM结合荧光寿命可以得到无标记的电、磁和机械信息，可以用来深入的研究样品。

系统介绍

AFM / NSOM系统

图1左是NTEGRA SPECTRA系统的照片，右是样品的激发原理。
该系统以AFM轻触模式工作。荧光通过显微镜透镜收集和聚焦到一个共焦针孔里。透过针孔的荧光通过一个内置于NTEGRA optics的单色仪分光，并投射在FLIM检测器上。我们会使用NTEGRA系统一个特殊的AFM探针配置，这个配置的优势在于可以用来研究不透明的样品。此外，除了样品扫描之外它还可以用来执行光束扫描，这是共定位测量和增强拉曼散射研究非常需要的功能。
对于AFM和FLIM成像，我们会把样品放置在一个三维压电平台上（如图1右所示），用来确保AFM的探针和样品表面的距离恒定和对x，y方向进行光栅扫描。压电平台在二维方向的移动距离是120μm，Z轴上的移动距离为10μm。试验中所有收集到的图像都是由覆有TiN的硅AFM旋臂通过轻触模式收集到的，旋臂的长度为125μm。探针的力常数为5.1N/m，可以兼容生物体的成像，共振频率为160 kHz。

FLIM系统

为了用于荧光寿命成像，我们对系统进行了升级，所用的设备具体型号是bh BDL-SMN 488 nm皮秒二极管激光器，bh Simple-Tau 150 TCSPC FLIM系统，bh HPM-100-40 GaAsP混合型探测器。图2是这些系统的组成。

图2，FLIM系统的组分，从左到右：bh BDL SMN 488 nm 皮秒二极管激光器，bh Simple-Tau 150 TCSPC FLIM系统和 bh HPM-100-40 GaAsP混合探测器。
BDL SMN二极管激光器产生50ps脉冲长度的488nm波长激光，重复率可以是80，50或者20MHz。激光具有束流剖面校正和 Qioptiq 型单模光纤连接器。输入到光纤的激光功率是2mW，重复频率是80MHz。如果加大脉冲时间的话还可以得到更高的功率。
Simple-Tau 150系统含有一个包含总线扩展电缆和扩展盒的笔记本。扩展盒里有bh SPC-150 TCSPC/FLIM模块和DCC-100探测器控制器。HPM-100探测器包括一个滨松R10467-40混合型PMT管，一个用于产生工作电压的高压发生器和一个GHz的带宽低噪声前置放大器。探测器的探测效率为50%，可以在脉冲之后探测。对于FLIM装置这是很好的光子效率：达到指定所需要的光子数很接近理想值。
SPC-150 TCSPC卡的荧光寿命成像是基于一个多通道的TCSPC过程，整个原理如图4左所示。TCSPC模块几首来自于探测器的单光子脉冲，来自激光的时间参考脉冲，以及来自于Nanonics系统压电控制器的同步脉冲输出（帧开始，线开始，像素开始）。对于每一个光子，TCSPC系统都会确定它在激光脉冲周期内的时间，t，以及扫描区域内的位置（x，y或者AFM探针）。通过这些信息，TCPSC系统可以建立具有x，y和t的光子分布。这样的分布包含通过包含一个激光脉冲周期内的完整荧光衰减曲线（t）的像素集合(x,y)。这个程序的优势在于它在每个像素点记录了一个完整的荧光衰减曲线，而不仅仅是一个荧光寿命。此外，它还具有接近完美的光子效率，可以使用任意的扫描速率。在激光扫描显微镜内（扫描速率为10⁶像素点每秒），采集得到的数据量很大。而在慢速扫描过程中，每秒的数据可能只有一帧。根据推论，如果积分时间和探测的速率是一致的，扫描速率和结果也是独立的。

图3，左，TCSPC FLIM的原理，右，AFM-FLIM系统的蓝图。LPF：长波通，DM：分色镜510lpxru，DET：HPM-100-40混合型探测器。
和64位SPCM 数据采集软件联用的SPC-150模块可以记录的图像像素大小达到了百万级。这样FLIM系统所记录的像素量级就和AFM中常用的像素量级相当。同时使用256, 1024和4096个时间通道能够达到的分辨率为2048 x 2048，1024 x 1024和512 x 512。当NSOM的衰减数据包含很快和很慢这样衰减速率差异很大的组分时，多时间通道的优势就体现出来了。
所有的数据都是按照上文描叙的原理记录的，在SPCM数据采集软件的FIFO Imaging模式里面采集，使用的数据分析软件是SPCImage。FLIM数据与AFM数据的联用来自于NT-MDT的NOVA软件。

样品制备

为AFM制备的样品在本质上和正常的为FLIM准备的样品一致，不同之处在于样品没有盖玻片，因为这样会导致AFM探针将无法接触到样品表面。

结果

用EGFP和phiYFPv转染的大肠杆菌

我们用EGFP和phiYFPv转染大肠杆菌，将细胞悬浮液沉积在载玻片上并干燥。我们分别观测了高度和相位（未列出）的图像，使用的软件是NOVA。图4A是较为密集的大肠杆菌的形貌（512x512 pixels），总的扫描范围为40x40μm。图4B到D显示了4x4μm大小的同样的数据。图4C是FLIM数据，图4D是FLIM数据和形貌数据的总和。图5是图4C中一个5x5像素点的荧光衰减函数。

图4，用EGFP和phiYFPv转染的大肠杆菌，A：大小为40x40μm的AFM数据，B：大小为4x4μm的AFM数据，C，大小为4x4μm的NOSM FLIM数据，颜色是荧光寿命，亮度是荧光强度，D：FLIM数据和形貌数据的总和，颜色代表荧光寿命，亮度代表高度。

图5，图4C中一个5x5像素点的荧光衰减函数。

用GFP转染的HEK细胞

图6是HEK（人胚肾细胞，human embryonic kidney）细胞的数据。从左到右分别是HEK细胞的AFM形貌数据、荧光寿命图像和两者结合的图像。

图6，HEK细胞，左，形貌，中，荧光寿命，从红到蓝代表200-600 ps，右，荧光寿命（颜色）和形貌（亮度）的结合。

聚合物

图7是共混聚合物的数据。从左到右分别是HEK细胞的AFM形貌数据、荧光寿命图像和两者结合的图像。图8是图7中右下的一个3x3像素点的荧光衰减函数。

图7，共混聚合物的NSOM FLIM数据，从左到右，形貌，荧光寿命，荧光寿命（颜色）和形貌（亮度）的结合。

图8，图7中右下的一个3x3像素点的荧光衰减函数。

总结

如果AFM/NSOM的系统可以提供一个来自于压电平台的同步脉冲信号，一个来自于脉冲激光的光学输出，以及来自于光子计数探测器的光学输出，那么它可以很简单的与FLIM系统联用。而这些需求都可以被NT-MDT NTEGRA系统很简单的满足。我们用一个bh的Simple-Tau 150 TCSPC FLIM系统，一个bh BDL-SMN皮秒二极管激光器，一个bh PMH-100-40混合型探测器建立起来的FLIM系统与NTEGRA系统联用。AFM FLIM系统的优势在于可以同时得到高分辨率的形貌数据和荧光寿命数据。这样的数据可以把形貌以亮度和荧光寿命以颜色的方式来一起展示。我们利用这项技术研究了大肠杆菌、HEK细胞和共混聚合物。这项技术经过改进之后还可以与荧光/磷光寿命成像、多波长激光复用、多波长探测以及NIR探测。
References
1.  W. Becker, The bh TCSPC handbook. Becker & Hickl GmbH, 6th Edition (2015), www.becker-hickl.com, printed
copies available from bh
2.  Becker & Hickl GmbH, BDL-SMN series picosecond diode lasers. User handbook, www.becker-hickl.com
3.  Becker, W., Su, B., Weisshart, K. & Holub, O. (2011) FLIM and FCS Detection in Laser-Scanning Microscopes:
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4.  Studier, H., Becker, W. Megapixel FLIM. Proc. SPIE 8948, (2014)
5.  Becker, W., Su, B., Bergmann, A., Weisshart, K. & Holub, O. (2011) Simultaneous Fluorescence and
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6.  Becker & Hickl GmbH, MWFLIM GaAsP multi-spectral FLIM detectors. Data sheet, www.becker-hickl.com
7.  W. Becker, V. Shcheslavskiy, Fluorescence Lifetime Imaging with Near-Infrared Dyes. Proc. SPIE 8588 (2013)
8.  J. Stadler. T. Schmid, R. Zenobi, Nanoscale chemical imaging using top-illumination tip-enhancement Raman
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（翻译：北京鼎信优威光子科技有限公司    汪 阳 博士）