摘要：本篇应用指南介绍了一种具有可换探头的光纤探针荧光寿命检测系统。激光经由单模光纤到达探头，样品的发射光通过多模光纤传输到检测器。实验系统中包括一个BH BDL-SMN皮秒二极管激光器，BH PMH-100混合型探测器或者MW-FLIM GaAsP型多波长检测器，和一个Simple-Tau 150 TCSPC系统。该系统具有高灵敏度和短采集时间。可以在0.5秒的采集时间内测得浓度为10^-7mol/L荧光素溶液的光滑荧光衰减曲线，或者以每张100 ms的速率测得自发荧光衰减曲线的时间序列。
 
和TCSPC系统联用的光学探针已经在各种生物组织的科研中得到了广泛应用。近日，Cui等人在小鼠大脑中植入了光导纤维，记录行为相关的钙离子信号。在这些应用中的限制主要是在激发光纤的可变散射图案产生的运动伪影。 Cui等人使用单模激发光纤解决了这个问题。但是使用单模光纤又会带来光纤的耦合问题，造成在试验中测量仪器无法自由的与研究活体连接和断开。新的微型单模光纤连接器可以解决这个问题。另外一种解决方式是使用包含一小段多模光纤的可植入探头，探头和单模激发光纤与多模探测光纤用一个新的微型光纤连接器连接起来。

系统架构

该仪器由图1所示，包括：光纤探针，可交换探头，激发激光，检测器，和TCSPC系统。
 
图1：包括光纤探头的BDL-SMN激光，HPM-100-40混合型探测器，和Simple-Tau 150 TCSPC系统的光纤光学TCSPC系统。
试验中的激光由BDL-SMN皮秒二极管激光器提供。激光注入到激发光纤的光纤探针内，测量对象发出的荧光信号通过探针的探测光纤输出到HPM-100-40探测器内。输入光纤是单模的以降低运动伪影。探测光纤是多模的，以获得较高的光收集效率。荧光衰减曲线是通过BH Simple-Tau 150 TCSPC系统记录的。
光纤探针的原理示于图2。光纤探针由带有Qioptiq兼容光纤连接器的激发光纤（单模）、带有FC连接器的探测光纤（多模）、微型光纤连接器和可交换的探针组成。探针包含一小段多模光纤。探针是整个系统中激发和探测光路中唯一共用的部分。因此结果中来自探针内玻璃的拉曼激发荧光信号非常少。探针和微型光纤连接器的照片示于图3。

图2：光纤探针的原理。

图3：左：可交换探头。右：连接探头与光纤的微型光纤连接器。

检测结果

HPM-100-40混合型探测器

用不同浓度的荧光素溶液对图1中的系统进行了测试。为了对比我们还记录了来自哺乳动物皮肤的自发荧光信号。图4的左右分别表示了荧光素钠浓度分别为10^-6mol/L和10^-7mol/L的荧光衰减曲线，哺乳动物皮肤的自发荧光衰减曲线，以及光纤探针的背景荧光衰减曲线。激发波长为473纳米，激发功率为20μW。图4左右的积分时间分别为0.5秒和5秒。
我们得到的结果表明即使是荧光素浓度为10^-7mol/L的试验中，探针的背景信号依然不会对测量造成影响。从溶液中获得的荧光信号强度和皮肤的自发荧光强度相当，而这两者的强度都比探针中的背景荧光大一个数量级左右。

图4：用HPM-100-40混合型探测器的测得的衰减曲线。左图和右图分别为荧光素钠浓度10^-6mol/L和10^-7mol/L的荧光衰减曲线，哺乳动物皮肤的自发荧光衰减曲线，以及光纤探针的背景荧光衰减曲线。激发波长为473纳米，激发功率为20μW。左右的积分时间分别为0.5秒和5秒。
应当指出的是，这些结果是在20μW这种较低的激光功率下获得的。一般认为试验中这个数量级的功率是活体检测安全的。而在使用探针时BDL-SMN二极管激光器的输出功率可以提高至超过1mW。

MW FLIM GaAsP多波长探测器

BH MW-FLIM多通道探测器 (基于PML-16的6通道探测器) 可以同时记录16个不同波长的荧光衰减曲线。试验中是使用镓砷磷化物阴极的MW FLIM GaAsP探测器来记录探针内的多波长信号。使用镓砷磷化物阴极的探测器效率是传统的双碱阴极探测器的五倍之多。图5表示了浓度为10^-7 mol/L的荧光素溶液信号和皮肤自发荧光信号，试验中的累计时间为0.5秒，激光能量为 20 µW。结果表明我们的试验装置即使是在极短的采集时间和极低的激发能量下依旧可以得到满意的多光谱衰减数据。

图5: MW-FLIM GaAsP探测器记录的多波长衰变数据。左: 荧光素钠浓度为10^-7 mol/L，采集时间为0.5秒。右图: 哺乳动物皮肤自体荧光，采集时间为0.5秒。激发波长473 nm，功率为20 µW。

时间序列记录

毫秒量级的数据采集时间足以记录活体内的生理变化。为了验证循环时间记录的可行性，我们观测了人体皮肤的自发荧光时间序列。探针在皮肤表面的扫描引起强度的变化，激发功率调整为100µW。TCSPC系统大约每秒记录约10⁶个光子。每秒能记录10次，即每条曲线使用100 ms，图6是一个典型的实验结果。

图6:以100毫秒的速度记录的皮肤的自体荧光时间序列曲线。使用的探测器是HPM-100-40 混合型探测器，激发功率为 100 µW。
图6中所示的每条曲线包含约100,000光子的数据。从100,000个光子中得到的荧光寿命相对精度大约是0.3%。这比大多数生物医学中实用中所需的精度都要高。如果只需1%的精度，每条曲线只需要记录10000个光子的数据。这意味着，荧光寿命曲线测量的速度可以增加到100条每秒而不会引入不可接受的误差。
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（翻译：北京鼎信优威光子科技有限公司   汪 阳 博士）