活体研究中的植入式光纤荧光寿命检测系统
这篇应用指南介绍了一种基于皮秒激光的便携式荧光寿命检测的时间相关单光子计数（TCSPC）系统。这个系统包括皮秒二极管激光器，单模激发光纤，一个或若干个多模探测纤维，高效率的单光子探测器。激发和检测系统可以通过小尺寸，低重量的光纤连接器和活体动物方便的实现或者断开连接。这个系统可以记录荧光衰减曲线、磷光衰减曲线、荧光衰减曲线的时间序列、强度追踪和荧光相关数据等等。通过外部激发和采集信号，我们可以记录毫秒范围内荧光寿命和强度的动态变化。
皮秒半导体激光器
试验中使用BH BDL-SMN或BDL-SMC皮秒二极管激光器激发荧光。可选的激光波长有405 nm、445 nm、473 nm、488 nm、515 nm、640 nm、685 nm和785 nm，脉冲宽度为50至90 ps之间，脉冲频率可以选择20 MHz，50 MHz或80MHz。根据波长和脉冲频率的不同，最大可用（平均）激光功率为约0.5mW到几毫??瓦之间。激光器如图1左侧所示，典型的激光脉冲如图1右所示。激光器用一个+ 12V电源操作，驱动线路集成在激光头部。
图.1：左：BDL-SMN皮秒二极管激光器。右：不同激光功率的脉冲形状。 波长为473nm，重复频率为80MHz。
光纤耦合系统
图2显示了试验中使用的激发和探测光纤。典型激发光纤直径为3μm，探测光纤的直径为25μm。激发光纤是单模光纤，这就避免了光纤弯曲会带来的模式波动运动伪影。探测纤维是多模的，以增加光收集效率。荧光信号是漫耦合到光纤中的并且具有很宽的波段范围，从而不会在探测光纤中发生由于模式变化引起的亮度变化。由于光纤的直径较小，可以直接植入活体。激发和探测光纤是分离的，或者可以耦合在一根探针当中。
图 2: 激发和探测光纤 (左)，结合激发/探测光纤探针 (右)。
活体研究中对于试验装置一个重要的要求是激发和探测系统可以很简单的与样本动物连接与断开。我们可以通过图2所示的小体积、轻重量的光纤和连接器实现这一点。图3是连接器的细节，光纤连接器的总重量大约为2g。
图 3:激发和探测的微型光纤连接器。断开 (左) 和连接 (右)激发和探测光纤系统的工作原理如图 4 所示。
图4: 激发和探测光纤系统的工作原理。
探测器
试验中我们使用BH HPM-100-40 混合型探测器检测荧光信号。这款结合精密技术的高效探测器检测范围高达约 700 nm，信噪比高，具有短仪器响应函数 (IRF) 和极低的背景信号。在近红外区用HPM-100-50 探测器波长范围可以达到900 nm。发射滤光片可以安装到检测器的光纤适配器内。此外还可以通过用一个分束镜耦合两个检测器同时检测两个不同波长的信号，如图5右侧所示。
图5: 左: HPM100混合探测器。右图:通过一个分束镜耦合的两个HPM100探测器。
图6是bh PML-SPEC型多光谱TCSPC检测器。这种探测器包含一个PML-16型的16 通道光电倍增管阵列和多色仪。它可以同时记录16个不同的波长的信号。2014 年开始，PML探测器开始配置GaAsP阴极，这种阴极的效率是传统的双碱阴极效率的五倍。PML-SPEC探测器会直接连接到下文详细描叙的TCSPC系统。探测器采用了bh的路由技术，因此只需要一个光子模块就可以记录16个通道的数据。和HPM 100探测器相比，PML-SPEC在光谱分辨率上具有优势。但是缺点是在多色仪中会损失一些信号，而且IRF也会更大一些。PML-SPEC主要应用于自发荧光，其中对于衰变数据的光谱分辨可以提供样本的必要信息。
图6: PML-SPEC型探测器。
TCSPC系统
图7中是一台完整的TCPSC控制系统，包含了一台连接到笔记本电脑的扩展盒。这个系统是基于完全的模块化设计。其他的实验控制模块或者TCSPC模块都可以加到这个系统当中。根据探测器的种类或者数目，TCSPC的通道数目从一个到四个不等。
图 7: simple-Tau TCSPC系统。包含高达四个TCSPC模块的扩展盒和笔记本电脑相连。
TCSPC系统使用了bh的多维光子技术，能够记录荧光衰减曲线，荧光衰减曲线随时间变化的序列，强度追踪和荧光相关数据，同时还可以记录磷光衰减曲线。通过外部激发和采集信号，我们可以记录毫秒范围内荧光寿命和强度的动态变化。如果用多波长探测器，可以同时记录16个不同波长的数据。
References：1. W. Becker, Advanced time-correlated single-photon counting techniques. Springer (2005)
2. W. Becker, The bh TCSPC handbook. 6th edition. Becker & Hickl GmbH (2014), www.becker-hickl.com. Becker, W., Su, B., Weisshart, K. & Holub, O. (2011) FLIM and FCS Detection in Laser-Scanning Microscopes:
Increased Efficiency by GaAsP Hybrid Detectors. Micr. Res. Tech. 74, 804-811
3. Becker & Hickl GmbH, 16 channel detector head for time-correlated single photon counting, user handbook, available on www.becker-hickl.com, (2006)
4. MW FLIM GaAsP detector. Data sheet, www.becker-hickl.com
5. Becker, W., Su, B., Bergmann, A., Weisshart, K. & Holub, O. (2011) Simultaneous Fluorescence and Phosphorescence Lifetime Imaging. Proc. SPIE 7903, 790320
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7. G. Cui, S.B.Jun, X. Jin, G. Luo, M.D. Pham, D.M. Lovinger, S.S. Vogel, R.M. Costa, Deep brain optical measurement of cell type-specific neural activity in behaving mice. Nature Protocols, 9(6) 1213-1228 (2014)
Contact:
Wolfgang Becker, Becker & Hickl GmbH, Berlin, Germany. Email: becker@becker-hickl.com
（翻译：北京鼎信优威光子科技有限公司 汪 阳 博士）
