FRET是两种发射带和吸收带重合的荧光团分子之间的相互反应。在这个反应中，来自于第一个染料分子-供体-能量瞬时转移到了第二个染料分子-受体-里。这两个分子的能量偶极转移，不涉及任何光的激发和吸收。图8左侧表示了FRET的原理，从供体到受体的能量转移的效率和距离的六次方成反比。对于有机分子染料而言，FRET小于只在分子距离小于10nm的情况下才非常显著。FRET会导致供体荧光的淬灭，从而减少供体的荧光寿命，如图8右所示。
由于其在分子尺度上与距离相关，FRET成为了细胞生物学上重要的工具。供体和受体荧光染料可以转染在不同的蛋白质上，FRET可以用来鉴别这些蛋白质是否是物理相连的，从而确定纳米尺度上的距离。

图8，荧光共振能量转移，左图是原理，右图是供体的衰减曲线。

稳态FRET测量

基于荧光强度的FRET测量可以通过观测供体和受体的荧光强度来计算它们的浓度。由供体和受体荧光的强度比可以用来得到“FRET效率”。但是这个测量中一个潜在的问题是FRET激发的供体强度不能直接测量。而且由于供体的荧光和受体的荧光之间有重叠，所以会发生“供体渗漏”，测得的供体荧光信号会有一部分来自于受体分子。如果想要得到高精度的结果，稳态FRET技术就要用只含有供体和受体的样本来进行精细的校准。
另一个问题是标记的化学计量。理想情况下，对于每一个受体分子和供体分子应该精确的标记，即不存在没有标记的分子，也不存在有超过一个标记的分子。这在实际中可能会实现。但是如果受体没有充分标记，我们得到的FRET效率就不能正确的反应供体与受体之间的距离。而如果对受体分子的标记处于过饱和状态，校正直接激发的受体荧光就非常困难。试验中甚至可能会发生供体与数个受体相结合的事情。这也会增加FRET效率，但是同时也会导致对于供体与受体之间的距离测量失真。

基于荧光寿命的FRET测量

FLIM FRET技术基于对于供体荧光寿命的测量。在试验中我们可以完全独立于受体荧光的测量供体荧光，这就不存在供体渗漏问题。FRET效率可通过对比独立的供体荧光与FRET中的供体荧光来得到。
图9就显示了一个类似例子。FRET导致的荧光寿命减少清晰可见，如右图的荧光寿命衰减曲线所示。

图9，HEK细胞的FERT。供体和受体分别由CFP和YFP标记。左图是供体的荧光寿命图像，是双指数模型的幅度权重荧光，右图是左图示意部位的荧光寿命衰减曲线。

基于双指数衰减分析FRET测量

基于FLIM的FRET测量的最大优势就是FLIM可以区分反应和没有反应的供体的数目。有若干原因会导致供体不会与受体反应。一个小小的原因就是供体或者受体分子可能没有正确的标记。另外一个可能的原因是受体分子和供体分子的取向是随机的，当供体分子垂直于受体分子时，它们不会发生相互作用。这个问题对于FRET效率计算的影响一般会通过引入“κ²因子”来解决。
一个更重要原因是试验中的蛋白质通常是活性与非活性蛋白质的混合物。活性蛋白质所占的分数以及蛋白质之间的距离都会影响传统的FRET效率。因此我们无法从传统的FRET效率不同中得知这是由于供体受体距离之间的不同还是活性蛋白质的分数不同造成的。
而TCSPC FLIM解决了双指数衰减分析的问题。我们可以通过一个双指数模型来拟合供体的荧光寿命衰减曲线，这两个指数包括一个未淬灭长寿命的非活性组分以及一个淬灭短寿命的活性组分。如果标记完全，比如在GFP变体的细胞表达融合蛋白试验中，经过κ²因子校正的衰减组分会正确的得到反应活性与非活性蛋白质的组分。图10表达了受体衰减函数的组成。
双指数衰减分析可以得到非活性与活性组分的荧光寿命τ₀和τ_FRET，以及它们的幅度a₁和a₂。从这些参数可以推算出活性蛋白的真实FRET效率，距离分布，Förster半径，以及活性与非活性供体分子的比率。请注意在这个实验中不需要再测量来自于一个只含有供体的细胞的参考荧光寿命数据。参考荧光寿命数据既是τ₀，受体中慢衰减组分的荧光寿命。这样得到的τ₀和τ_FRET来自于同样的细胞环境。因此在合理的限制下双指数FRET得到的荧光寿命独立于环境变化所引起的荧光寿命变化。

图10，FRET系统的荧光衰减组分。
图11是图9中细胞的双指数分析示例。左图表示了非活性和活性供体荧光寿命分数比τ₀/τ_FRET。τ₀/τ_FRET在左图显示了不同区域的比率，不同区域内的最大差别是10%，对应的距离差距只有2%。但是强度因子的差距，a₁/a₂，在10倍的数量级上。而得到的结果表明图9中的单指数荧光寿命的涨落来自于活性蛋白比例的改变，而不是距离的改变。换而言之，把单指数荧光寿命（或者来自于稳态实验的经典FRET效率）的变化仅仅理解为距离的变化是错误的。
双指数衰减行为最先是在多维TCSPC的FRET试验中发现的，在条纹相机测量中也证实了双指数衰减曲线。这雄辩地证明了双指数衰减是来自于活性与非活性的供体组分。

图11，双指数荧光寿命分析FRET结果。左图，τ₀/τ_FRET，右图，活性供体与非活性供体的幅度比a₁/a₂。
双指数衰减曲线对于利用FLIM数据来计算传统(稳态)的FRET效率有影响。双指数衰减曲线不能用一个荧光寿命来描叙。为了得到正确的能量转移效率，必须使用两个荧光寿命组分的幅度权重平均来计算。幅度权重平均不同于单指数拟合得到的荧光寿命。因此，我们只能用双指数衰减分析得到正确（传统）的FRET效率。
需要指出的是FRET实验存在着一些缺陷：化学计量可能是错的，被正确标记的供体可能会与没有正确标记的受体反应，或者受体分子被过度标记导致供体分子会与几个不同的受体反应。供体也有可能会含有多指数衰减函数，或者供体信号中含有一部分的自发荧光，又或者试验中一部分受体会被光漂白。此外固定细胞内的FRET测量可能会发生问题。固定不仅仅会改变蛋白的构象，也会引起不可预测的荧光寿命改变和供体的多指数衰减行为。解决这些问题没有必要用到FLIM，但是FLIM可以用来定位如何解决这些问题。