显微镜学家经常把荧光寿命当作一个附加的参数用来分辨不同的荧光团。不同的荧光团具有不同的荧光寿命，可以通过FLIM来分辨它们的信号。当然利用光谱分辨显微镜技术可以更容易和更好分辨不同的荧光团。
因此典型的FLIM应用都没有关注不同荧光团的分辨。而是用来分辨在不同环境下相同荧光团表现出的不同函数。这是利用了荧光团一个基本的性质，即在合理的范围之内，荧光团的荧光寿命取决于其分子环境而不是浓度。因此荧光寿命可以用来独立的研究不同而且通常未知荧光团浓度下的分子效应。
在FLIM应用中通常用到的效应有：
- -•不同离子，特别是对于神经系统功能非常重要的钙离子和氯离子，的荧光淬灭或者磷光淬灭。
- -•氧的荧光淬灭或者磷光淬灭。对于大多数荧光团，特别是荧光寿命比较长的荧光团而言，氧气是非常有效的淬灭剂。一个重要的实验就是观测氧气对于钌，铕，铂和钯的复杂氧化物磷光的强淬灭作用。
- -•内源性荧光团，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤核苷酸（FAD），存在着很强的氧效应。科学家在二十世纪三十年代就已经发现了类似的效应。Chance等人定义了氧化还原比作为氧在细胞的线粒体中使用量的直接指标。氧效应也可能存在于其他的内源性荧光团。
- -•荧光团与生物目标的结合会改变荧光寿命。最有可能的机理是结合会改变荧光团的结构，继而改变内部无辐射衰减率。对于绝大多数应用于细胞生物学的染料而言，它们的荧光寿命或多或少的取决于它们结合的是蛋白质、RNA或者DNA，对于与蛋白质结合的那些染料而言，它们的荧光寿命同样也取决于蛋白质的结构。比如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤核苷酸（FAD）就会因为与蛋白质结合而改变它们的荧光寿命。研究同样发现，细胞和组织的代谢结构同样会非常显著的影响荧光团的荧光寿命和强度。
- -•pH值：许多荧光团既含有质子化形式，也含有去质子化形式。这两者的平衡取决于溶液的酸碱性。如果质子化形式和去质子化形式的荧光寿命不同，这种荧光团就可以用来指示溶液或者细胞环境的pH值。
- -•荧光能量转移：荧光能量转移，或者又被称之为FRET，指的是能量从第一个分子，供体，转移到第二个分子，受体，的反应。人们一般通过FRET来研究蛋白质的构象和反应。对于FRET的观测是FLIM最常见的应用之一。
- -•聚集：染料分子的辐射和非辐射衰变速率取决于染料分子可能出现的聚集。聚集会受到染料分子微环境的影响;相关联染料分子荧光寿命的变化可以当作探针。聚集也用来观察染料在细胞中的内化。
- -•粘度：我们可以通过“分子转子”来检测粘度。分子转子指的是具有高度内灵活性的荧光团。荧光团的旋转可以表现为辐射衰变路径。而溶剂的粘度变化表现为非辐射衰减率的变化。Kuimove和Levitt首先报道了用分子转子和FLIM技术检测粘度的方法。
- -•接近金属表面：可以想象，当荧光团接近金属表面，特别是金属纳米颗粒的表面时，会对荧光团的衰减曲线有很强的影响。与之类似的，最近的研究也报道了荧光团接近非金属的纳米颗粒会导致稍微弱一些的效应。
- -•纳米颗粒：通过纳米颗粒较长的衰减时间或者二次谐波发射，FLIM可以用来鉴别和定位生物组织内的纳米颗粒。这项技术可用来研究药物载体纳米颗粒或者纳米颗粒在皮肤上的扩散。
