由于荧光技术极为敏感并且能在分子尺度上提供生物化学信息，从而被人们广泛应用于显微镜活体研究中。除了需要在样品上标记荧光团之外，荧光技术基本无创、无损，可以直接应用于活体样本上。而多维显微技术的引入也加速了荧光技术的发展。在试验中可以获得不同维度的实验数据，比如波长、试验时间或者光的偏振方向。而且荧光特征不仅仅包括荧光强度的空间分布和荧光光谱，还包括荧光衰减函数：当分子吸收光子进入激发态，它可以以不同的方式返回基态，包括发射光子、转化成热量或者杂交到三重态。对于同源性分子得到的荧光衰减曲线是单指数函数。这个函数的时间常数，荧光寿命，是所有可能的返回路径速率的倒数之和。速率常数，即荧光寿命，取决于分子类型、环境、构象以及与周围分子的相互作用。
在所有可以测得的荧光参数中，荧光寿命是可以最直接的表达荧光团标记分子与周围环境相互作用的参数。由短脉冲激光激发荧光可以得到荧光衰减函数，激光脉冲后的荧光寿命测量精度可以达到纳秒量级，乃至皮秒量级。

图1，TCSPC FLIM原理

FLIM技术

荧光寿命成像（FLIM）可以通过时域、频域、光子计数、模拟技术、点扫描和宽场成像等等技术来实现。不同技术之间的区别取决于获取数据时使用的时间通道多少，采集数据时是同时采集还是按顺序采集。科研工作者们穷尽了几乎所有的组合，这导致了市场上的仪器原理各异。不同原理仪器的差别主要体现在：光子效率，即得到给定的寿命精度所需的光子数；记录这些光子所需的累计时间；时间分辨率内的光子通量；多指数荧光寿命衰减曲线的分析；多波长能力；光学切片能力和与不同成像与显微镜技术兼容性的参数。

时域TCSPC-FLIM技术

时间相关单光子计数（TCSPC）FLIM使用了多维时间相关单光子计数程序，这是对经典TCSPC技术的一个扩展。图1是这项技术的原理示意图。试验中用高频的脉冲聚焦激光扫描样品。对于数据的记录基于对单光子荧光的检测，以及利用激光脉冲和探测时的位置来确定光子到达时间。根据这些参数，我们可以描述光子的空间坐标,（x,y），和脉冲激发光子所需要的时间，t。这样我们可以得到一组三维的数据，包含二维扫描的像素点以及大量时间通道内得到的荧光寿命。
在本文所描述的多维TCSPC FLIM技术可以达到目前最高的时间分辨率。在来自样品的光子数目稳定的情况下，它同时还具有最高的寿命准确性和光子效率。TCSPC FLIM系统具有许多生物系统寿命成像所需要的重要特征：能够拟合复杂的衰变曲线；能够克服在采集过程中荧光衰减参数的动态变化。此外，TCSPC FLIM技术还可以完美的兼容共焦或者多光子扫描显微镜。这些系统中的快速扫描速率也不会影响TCSPC FLIM的结果：记录程序只需要采集到让信噪比足够大的图像就可以了。此外，TCSPC FLIM技术还利用了共聚焦和多光子扫描能达到光切片的优势：采集到的数据来自于样品的特定平面，不会受到来自于焦平面之外的荧光的污染。
光子分布可以得到很多参数，比如光子的波长，或者几个多路激发激光器的波长，又或者样品非周期性刺激的时间。可以通过分光荧光光谱和突出多阳极光电倍增管里元素的光谱来得到光子的波长。FLIM系统决定了探测了特定光子的PMT通道（或者波长通道）数目。数据记录过程可以得到光子的空间坐标，x，y，光子时间，t，和波长通道，λ。数据记录了在不同波长下特定坐标的的衰减曲线。Biskup和Rück报道了TCSPC在光动力治疗染料和FRET研究领域中的应用。
试验中可以用一个类似的过程得到不同波长下的荧光寿命图像。不同的激发波长可以在帧与帧、行与行切换，甚至在一个像素点内共存。此时激光波长通道可以用来作为光子分布的坐标。
快速动态过程可以通过在激发样品的激光脉冲之后附加一个时间坐标来记录。科研工作者开发了一种名为“荧光寿命瞬时扫描”的技术用线扫描来记录小至1 ms时间分辨率的荧光寿命改变。
为了得到FLIM数据，TCSPC系统必须记录单个可探测光子的完整信息。在研究中这类“光子参数数据”可以用在许多方面，比如单分子探测，荧光相关光谱和磷光寿命成像。
科研工作者普遍认为TCSPC FLIM系统一个劣势在于较长的积分时间。正如Becker和Katsoulidou指出的，这个劣势更像是一个普遍的误解而不是真实存在的劣势。实际上，TCSPC FLIM系统对于图像的记录不会比扫描仪对于样品的扫描更慢。当然TCSPC系统的计数速率存在着天然的限制。但是对于典型TCSPC FLIM系统的应用而言，计数速率的限制更多的来自于样品的成像稳定性而不是FLIM系统的计数速率。鉴于其接近理想的光子效率，可以说TCSPC FLIM系统能在所有基于样品扫描的FLIM系统上所需要的积分时间最短。

门控影像增强的时域FLIM

图像增强器包含有光电阴极真空管，可以增益光电子的二维图像检测系统。图2表示了如何用多通道平板来增益电子。一个典型的微通道板的增益是1000倍左右，2个联用的平板可以达到10⁶倍之多。

图2，门控图像增强器。
试验中我们可以通过门控影像增强器得到时间分辨率。这是通过在多通道平板和光电阴极或耦合到导电格电容之上的光电阴极之间的门控脉冲来实现的。可以通过扫描门控时间内的荧光衰减函数，即图2右中的通过采取不同延迟选通脉冲的连续图像。
门控影像增强器一般会和宽场激发或者多光子多光束扫描联用。宽场图像的优势在于可以得到所有像素点的信息。虽然在实际实验中用时间信息顺次所用的采集时间可以做得比用于基于空间扫描技术短。
门控记录的缺点是仅仅能记录一部分光子，导致光子效率较低，而整体的样品曝光较高。而且宽场激发会引入激发平面之外的荧光。只有样品非常薄的情况下才不会受到焦平面之外荧光的污染。来自焦平面之外荧光的污染不仅仅会带来图像对比对的失真，也会给荧光衰减函数带来不必要的组分。
我们可以通过仅仅记录一小部分时间门控数据解决效率问题。这些时间门控的图像可以通过不同延迟的光阴极来按顺序或者同时采集数据。但是这会带来衰减函数的采样不足，所以很难通过荧光寿命和振幅来得到多指数荧光寿命衰减曲线的拟合。

图3，频域FLIM原理，荧光寿命可以通过减少荧光相比于激发光的调制角度和相移来得到。
从理论上说，我们可以用结构照明技术去除焦平面之外的信号。但是这类技术都是基于对不同照明参数得到的图像结果差异进行的计算优化。虽然我们得到的图像只包含来自于焦平面的信号，但是图像中还含有来自于所有荧光检测平面的散粒噪声。
基于门控影像增强器的系统可以用来得到多光谱的FLIM。试验中我们用相同的门控影像增强器管，用一个相同的门控扫描得到不同波长下的间隔图像。此外还可以激发样品上的一条线，或者把这条线上的荧光投影在光谱仪的入口狭缝内。这样在试验中我们可以通过移动样品或者激发垂直于这条线的延伸来扫描样品的不同部分。通过门控图像增强器记录光谱仪的输出的光谱。这样激发线和光谱仪的狭缝会形成一个共焦系统，可以抑制焦平面之外的信号。

频域FLIM技术

我们可以通过傅里叶变换来实现时域和频域技术的转化。时域技术得到的数据会在不同的时间通道内标识强度值。而在频域技术中类似的技术可以表示为信号重复频率内的幅度与相位值。但是这不意味着时域和频域这两种技术的记录原则和仪器完全一致：时域技术中，我们会记录大量时间通道内的全波形数据。但是在频域技术中，我们无法同时记录所有重复波形与其谐波的幅度与振幅。所以，大部分频域FLIM技术都只记录基波的频率和相位值。这样得到的数据可以用来表征样品的荧光衰减相位，具体可见“数据分析”章节。
图3是频域技术的大体原理。我们使用调制或者脉冲光激发样品。由此得到样品荧光相比于激发光有角度和相位的差异，由此可以用来确定荧光衰减曲线。
科研工作者一般会使用增益调制的相机或者宽场激发，又或者使用增益调制点探测器扫描和探测荧光来得到频域FLIM数据。图4是这项技术的原理。探测器或者相机的增益由震荡频率，f_OSC，调制，这个频率的含义与激光频率或者调制频率，f_laser，有少许的差异。然后，我们可以把荧光信号的相位和幅度转化为不同的差频，f_laser- f_OSC。这项操作和电台使用的外差技术相同。实际上有科学家报道了使用低成本通讯组件来搭建频域FLIM系统。外差原理的优点在于差频独立和差频频率较激光频率要低很多。我们可以通过数字技术来进行滤波和信号处理得到了不同的频率，这些频率决定了相位和幅度。

图4，频域FLIM技术，左，调制相机，右，扫描和调制的点探测器。
对于激发光和探测的调制并不需要一定是正弦波。因此频域系统可以使用高频的脉冲激光。
在频域FLIM技术中，我们把荧光信号视为一个模拟的波形，而不是一个独立的光子探测事件。因此带来的后果就是实验计数非常大，很难探测单光子事件。问题可能在于平均而言，探测器对于时间间隔内相位计算时如果只接受了一个光子，那么得到读数非常低。
仪器的一些细节也决定了频域FLIM技术的光子效率。激发光源和探测器的调制角度的加大会增加光子效率。一般而言，理想的调制意味着对于激发光强度和探测器的增益都在-100%和+100%之间波动。对于正弦激发而言由于参数极性不能翻转，这个要求无法达到。只有使用短脉冲激光和方波信号调制探测器的情况下才能得到最好的光子效率。此外探测器的增益调制或者光子探测效率的调制也会影响到光子效率。效率调制会抑制一部分的光子信号，导致信噪比劣化。
Gratton等人在2003年通过实验对比了TCSPC FLIM系统和调制点探测器的频域FLIM 系统。他们报道中提及对于低浓度和低计数样品而言，TCSPC FLIM系统能够给出更好信噪比的荧光寿命结果。而在高浓度高计数的样品环境下，这两种技术信噪比相当。

其余的FLIM技术

实际科研中还存在着种种其他的FLIM技术，它们之中的一些会和显微镜联用。我们将在这儿简单的介绍一下这些技术。
时间门控光子计数和激光扫描联用来记录荧光寿命图像的技术可以得到很高的光子效率和相当大的计数。这项技术里面使用的计数器是有数个平行门控计数装置的高速探测器。从原理上说，门控计数可以处理极高的计数，甚至可以超过探测器的过载极限。代价是时间门控数目非常有限，因此很难得到时域数据，而对这样的数据进行多指数衰减曲线拟合从而得到荧光寿命的振幅和参数也是一件非常困难的事。
条纹相机和激光扫描显微镜联用也可以用来记录FLIM数据。条纹相机可以同时记录试验数据的x和t。我们可以用条纹相机来记录多光谱FLIM数据或者在数据读出之前记录对一条直线的扫描。此类系统的表现依赖于条纹相机的参数，特别是读出速率和相机能处理的激发脉冲速率。
TCSPC系统还可以和位敏探测器联用，这样我们就可以得到一个具有单光子敏感性和绝佳时间分辨率的宽场FLIM技术。缺点是无法得到与深度相关的信息。
(扫描)TCSPC FLIM技术还可以和多光束扫描联用。我们把来自于几个不同的激发点的光信号引入到多阴极光电倍增管的阳极，使用一个单独的TCSPC模块来对荧光衰减、扫描坐标、多阴极光电倍增管的探测通道的光子进行时间分辨。这个系统的原理与平行TCSPC通道的原理类似。已经有科学家使用八平行通道的TCSPC系统来成功的构建多光谱FLIM系统。
如果只需要不是太高时间分辨率的宽场FLIM，可以使用门控或者调制的电荷耦合器件 (CCD) 图像传感器。这样构建系统技术简单，费用低，但是无法分析亚纳秒或者皮秒分辨率的FLIM数据。
在TCSPC技术发展的早期阶段，人们试图构建基于单光子雪崩二极管阵列的图像传感器，具体实验中必须冷却这些阵列来让单光子雪崩二极管工作。通过积分每个像素点或者像素行上传感器芯片的时数转化器，可以得到光子的时间。这个技术的缺点是暗计数过高，而且需要很高的读出速率：对于一个一共有100000个像素点的阵列而言，它的暗计数为10⁶光子/秒。信号的计数应该比这高出10到100倍才能得到较好的结果。试验中记录每个光子的位置和时间数据需要24比特的数据。所以对于这个阵列而言，数据的读出速率需要达到240 Mb/s到2.4Gb/s。如此高的数据传输要求很难达到，但是依然存在满足要求的可能。可是如此高速的时间和数据传输电流会产生热量。这让对于阵列的低温冷却很难保持，这又反过来加剧了暗计数。
Petrasek和Suhling报道了带有快速读出相机的影像增强器的荧光寿命成像装置。利用具有出色光学分辨率的相机系统来探测单光子和得到它的x-y位置。由于没有使用门控技术，这个系统具有极高的光子效率。在初次接触这个系统的时候，读者可能会认为这个系统的时间分辨率极限是相机的最大帧速率（250kHz）。但是，Petrasek和Suhling发现可以使用在图像增强器上荧光团的发光衰减时间输出来得到帧图像内的光子抵达时间。最后可以得到的时间分辨率是40 ns。

数据分析

图5，时域FLIM系统的数据分析。

时域数据

来自于TCSPC FLIM系统或者门控摄像系统的时域FLIM数据包含了一系列(通常数量巨大)时间通道内的阵列像素点数据。时间通道包含了激发之后连续光子数目，如图5中所示。我们会使用一个迭代卷积过程来计算得到数据中的荧光衰减曲线参数。我们计算得到的合适的荧光衰减曲线模型一般会由有些晦涩的概念：仪器响应函数（IRF）表达。IRF表示探测系统对于激发脉冲的响应。仪器响应函数的计算或者测量也是从荧光衰减数据得到的。在近几十年的试验中，这项技术被用于单指数荧光衰减曲线。对于FLIM而言，拟合过程必须针对图像的所有像素重复进行。
最简单的荧光衰减模型是单指数函数，即函数中只有一个单指数的衰减时间函数。但是对于大多数的情形而言，衰减曲线函数的拟合需要两个或者更多的指数。这样的模型里面包含了几个不同的衰减时间和幅度因子。最终呈现在FLIM上的图像包含了用亮度表示接收到光子数目，用颜色代表选择得到衰减参数（如图5右所示）。参数可以是单指数衰减函数的荧光寿命，或者是幅度/强度权重平均的多指数衰减曲线的荧光寿命，又或是简单的荧光寿命或者幅度比。
我们可以对分析算法进行若干改进，这些改进有助于高效的从噪声衰减曲线里面提取样品的衰减曲线。这样的算法包括最大似然分析或贝叶斯分析。即使是在低技术指标的单指数荧光寿命中光子分辨技术依然可以在第一时间（即光子到达探测器的平均时间）识别光子。第一时间的衰减数据与IRF得到的荧光寿命有所不同。第一时刻的计算亟需弱背景和完整记录一整段衰减曲线的情况下来计算。在满足这样的情形下计算第一时刻可以得到理想的信噪比。但是缺陷在于这对多指数衰减函数的拟合无能为力。
Weidkamp-Peters等人在时域技术的基础上发展了多指数分析。这项技术可以在一个探测通道内建立不同像素几个衰减参数的二维直方图，或者是不同探测通道得到的衰减指数和强度比例。在这些直方图里可以搜寻或者标记荧光团或者荧光团部分的特征，图像中对应的点也可以备注。

频域数据分析

每个像素点内的频域数据都包含两个信息：相位和调制角度。Digman开发的指针分析法可以优雅的分析这些数据。指针分析法并不是直接确定每个像素点的荧光寿命或者衰减指数，而是通过相位和调制角度来直接得到这些信息。对于每个像素点而言，我们可以在一个极坐标系里面定义一个指针（Phasor）。相位就作为这个指针的角度，调制角度就是这个指针的幅度。这样得到的点有几个显著的优势：

• 对于单指数衰减曲线而言，每个像素的向量值集合是一个半圆。向量的角度就是像素在半圆之上所处的位置，这个值取决于荧光寿命。
• 对于多指数衰减曲线而言，集合了数种衰减曲线的组分会落在半圆之内。
• 不同过程卷积的衰减曲线向量会落在半圆之外。例如FRET激发受体的发射，这就是供体与受体荧光衰减曲线的相互作用带来的卷积。

图6，Phasor分析。我们有五种不同的细胞，分别用YFP(B)、paxillin-CFP(C)、EGFP(D)和RAICHU-Rac1(E)转染，（F）是未转染的细胞，只有自发荧光。
具有不同特征向量点的像素会被在成像结果内用不同的颜色备注出来。图6就是其中的一个例子。在图6的上方从左到右，B-F，显示了不同细胞的相位点。细胞分别由黄色荧光蛋白（B），桩蛋白-青色荧光蛋白（C），增强型绿色荧光蛋白（D）和RAICHU-Rac1（E）转染。（F）是未转染的细胞。从图下部可以看出来自于不同向量点的荧光团落在了不同点上，也包括了未转染的细胞。值得注意的是所有的点都落在半圆之内，这表明在细胞环境下没有荧光团分子能表现出完美的单指数衰减曲线。
向量分析不仅仅限于在频域系统内得到的数据，还可以用来处理通过傅里叶转化的时域数据。